疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有適度疏水性的填料作為固定相，以含鹽的水溶液作為流動(dòng)相，利用溶質(zhì)分子的疏水性質(zhì)差異從而與固定相間疏水相互作用的強(qiáng)弱不同實(shí)現(xiàn)分離的色譜方法。由于疏水作用色譜的分離原理*不同于離子交換色譜或凝膠過(guò)濾色譜等色譜技術(shù)，使得該技術(shù)與后兩者經(jīng)常被聯(lián)合使用分離復(fù)雜的生物樣品。目前該技術(shù)的主要應(yīng)用領(lǐng)域是在蛋白質(zhì)的純化方面，成為血清蛋白、膜結(jié)合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細(xì)胞等分離時(shí)的有效手段。

對(duì)于小分子物質(zhì)，根據(jù)其極性的大小可以分為親水性分子和疏水性分子，一般來(lái)說(shuō)親水性的小分子是很難與HIC介質(zhì)發(fā)生作用的。但對(duì)于疏水作用色譜的主要對(duì)象生物大分子如蛋白質(zhì)而言，其親水性或疏水性是相對(duì)的，即使是親水性分子也會(huì)有局部疏水的區(qū)域，從而可能與HIC介質(zhì)發(fā)生疏水作用，因此能夠根據(jù)其疏水性的相對(duì)強(qiáng)弱不同進(jìn)行分離。

HIC介質(zhì)是在特定的基質(zhì)如瓊脂糖上連接疏水配基如烷基或芳香基團(tuán)組成的。HIC介質(zhì)與具有疏水性的生物分子間的作用被認(rèn)為與疏水性分子在水溶液體系中的自發(fā)聚集一樣，是由熵增和自由能的變化所驅(qū)動(dòng)的。鹽類在疏水作用中起著非常重要的作用，高濃度鹽的存在能與水分子發(fā)生強(qiáng)烈作用，導(dǎo)致可以在疏水分子周?chē)纬煽昭ǖ乃肿訙p少，促進(jìn)了疏水性分子與色譜介質(zhì)的疏水配基之間發(fā)生結(jié)合。

因此在HIC過(guò)程中，在樣品吸附階段采用高鹽濃度的溶液，使得目標(biāo)分子結(jié)合在色譜柱中，而在洗脫階段，采用降低洗脫劑中鹽濃度的方式使溶質(zhì)與色譜介質(zhì)間的疏水作用減弱，從而從色譜柱中解吸而被洗脫下來(lái)。對(duì)于以芳香基團(tuán)作為疏水配基的色譜介質(zhì)來(lái)說(shuō)，還存在潛在的發(fā)生π-π作用的可能當(dāng)待分離物質(zhì)表面具有芳香基時(shí)，就會(huì)表現(xiàn)出疏水作用和π-π作用的混合分離模式。

從理論上看，HIC和RPC是兩種密切相關(guān)的液相色譜技術(shù)，它們都是基于生物分子表面的疏水區(qū)域與色譜介質(zhì)上的疏水配基（烷基或芳香基）之間的流水相互作用，然而在分子水平的色譜機(jī)理以及實(shí)踐層面上這兩種技術(shù)是有所不同的。

RPC介質(zhì)上疏水配基的取代程度大大高于HIC介質(zhì)。RPC介質(zhì)可以認(rèn)為是連續(xù)的疏水相，其配基如C4~C18烷基的取代程度通常在數(shù)百微摩/mL凝膠：而HIC介質(zhì)上配基如C2~C烷基或簡(jiǎn)單芳香基的取代程度通常在10~50mmol/mL凝膠范圍內(nèi)，可以看作是不連續(xù)的疏水相，在與生物分子結(jié)合時(shí)由一個(gè)或數(shù)個(gè)配基參與。

那么很顯然，疏水溶質(zhì)與RPC介質(zhì)間的作用力要比HIC介質(zhì)強(qiáng)得多，需要使用有機(jī)溶劑梯度等劇烈的洗脫條件才能將溶質(zhì)從色譜柱中洗脫下來(lái)，對(duì)于球狀蛋白質(zhì)，在這樣劇烈的洗脫條件下往往會(huì)發(fā)生變性，因此RPC適合在水-有機(jī)溶劑體系中具有良好穩(wěn)定性的肽和小分子蛋白質(zhì)的分離純化、而HIC過(guò)程的洗脫條件要溫和得多，通常降低洗脫劑的鹽濃度就能達(dá)到目的，因此HIC既利用了蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)，又能夠在更為極性和低變性的環(huán)境中進(jìn)行，因而在蛋白質(zhì)的純化中有著更為廣泛的應(yīng)用。

流動(dòng)相條件對(duì)HIC的影響主要表現(xiàn)在所用鹽的種類和濃度、流動(dòng)相的pH，以及其他添加劑的影響。HIC過(guò)程是在高鹽濃度下實(shí)現(xiàn)樣品的吸附，而后在低鹽濃度下完成洗脫過(guò)程。顯然，流動(dòng)相中鹽的種類和濃度是HIC中至關(guān)重要的參數(shù)。不同的離子，特別是陰離子在HIC中的作用是不同的。有些離子存在于溶液中時(shí)會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，它們能夠增加疏水作用；而另一些離子的存在卻會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，稱為促溶鹽類，它們的存在會(huì)破壞疏水作用。下表指出了不同離子對(duì)疏水作用的影響，表中左邊的離子能夠促進(jìn)疏水作用，因而經(jīng)常在HIC中使用，而右邊的離子屬于促溶離子，它們能破壞疏水作用，有時(shí)在對(duì)色譜介質(zhì)進(jìn)行清洗時(shí)可以用來(lái)洗脫一些結(jié)合特別牢固的雜質(zhì)。

在所用鹽的種類已經(jīng)確定的情況下，鹽濃度的高低會(huì)影響到溶質(zhì)分子與色譜介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度及色譜介質(zhì)的結(jié)合容量。鹽濃度的升高能促進(jìn)疏水作用，因此HIC通常都是在高鹽濃度下加樣并完成吸附，而通過(guò)降低洗脫劑中鹽濃度的方法進(jìn)行洗脫。除此之外，色譜過(guò)程的起始鹽濃度的高低還會(huì)影響色譜介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合容量。

溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環(huán)境。一般情況，溶液的pH接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，其疏水性增加，有利于與固定相配基相互作用；遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)，其疏水性減少，不利于與固定相配基結(jié)合，但有利于蛋白質(zhì)洗脫。因此通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H也可以改變蛋白質(zhì)的疏水性。

不同鹽類對(duì)疏水作用的強(qiáng)度有影響，層析中的選擇性也不盡相同；鹽濃度也隨目標(biāo)分子的疏水性而異，(NH₄)₂SO₄常用0.75~2mol/L，NaCl為1~4mol/L；洗脫方式zui常用降低流動(dòng)相中鹽濃度的方式洗脫，流動(dòng)相B為含鹽量較低的緩沖液，緩沖液類型與流動(dòng)相A一致，B%由0→100。往流動(dòng)相中添加有機(jī)溶劑 ，如：乙二醇、丙醇、異丙醇等，降低流動(dòng)相極性的方式洗脫 ；往流動(dòng)相中添加去污劑等 ，去污劑本身能與介質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈吸附，從而將結(jié)合在其上的目標(biāo)組分置換下來(lái)。